問題1. 一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜有什么區(qū)別?什么時候做一級，什么時候做二級?
答：一級質(zhì)譜鑒定的方式主要指胎指紋圖譜(PMF)，即利用質(zhì)譜儀測量酶解片段的分子量并搜庫比較實現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定，二級質(zhì)譜是在一級質(zhì)譜的基礎(chǔ)上再選擇部分肽段做進一步的破碎并對碎片進行深入分析和比較，鑒定出該肽段的序列并結(jié)合PMF的結(jié)果從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。二級質(zhì)譜能夠得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。隨著現(xiàn)在雜志對數(shù)據(jù)的要求越來越嚴格，二級質(zhì)譜鑒定是蛋白鑒定的大趨勢，而且即使目前做一級質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，也需要挑選部分PMF結(jié)果做二級質(zhì)譜驗證。

問題2. 研究的物種不是模式生物怎么辦?
答：可以參考親緣關(guān)系近的模式生物做比對而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的成功鑒定，如果質(zhì)譜圖很好而沒有鑒定結(jié)果說明這是一個全新的蛋白，可以采用de-novo等技術(shù)做深入分析與鑒定。

問題3. 該如何評價質(zhì)譜效果的好壞?
答：做PMF一般得分超過60分(P<0.05)就算成功鑒定，而串聯(lián)質(zhì)譜，得分超過60分或者雖然沒有超過60分，但是有少一條肽段的得分超過30分就算成功鑒定。

問題4. 一些特殊的質(zhì)譜方法有什么用途?
答：質(zhì)譜的其它用途包括磷酸化位點分析、蛋白測序、混合蛋白鑒定(shotgun技術(shù))以及分子量測定、二硫鍵位置分析等等。

問題5. 用什么染色方法比較好?
答：用考馬斯亮藍法進行染色，銀染也可以，但鑒定成功率稍低，并且推薦用串聯(lián)質(zhì)譜對銀染蛋白進行鑒定可以大大提高鑒定成功率。

問題6. 凝膠是否可以長期保存?該如何保持?對鑒定效果有影響嗎?
答：如果保存時間超過一個月，可以用保鮮膜包裹后放入冰箱保持，如果小于一個月，則可以常溫保持，不會影響質(zhì)譜鑒定效果。

問題7. 質(zhì)譜鑒定取膠點該如何取?有什么注意事項?
答：取點的時候?qū)?.2ml的槍頭前端剪去一點，用槍頭將凝膠戳取下來并轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復(fù)吸打沖洗兩至三次，吸干離心管中所有水分封蓋保存。離心管用進口離心管，以免塑料污染;水用去離子水或者雙蒸水;取點的時候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。

問題8. 凝膠是否可以長期保存?該如何保存?如何運送?
答：蛋白凝膠可以長期保存而不影響質(zhì)譜鑒定效果，一般而言，如果在一兩個星期以內(nèi)，用保鮮膜包好，放到4度冰箱保存，如果保存時間超過一個月，可以把蛋白點取下后放入-20度或者-80度冰箱，不會影響后續(xù)質(zhì)譜鑒定效果。運送膠點的時候采用常溫運送即可，三五天內(nèi)都不會有太大的影響。

問題9. 質(zhì)譜鑒定取膠點該如何取?有什么注意事項?
答：取點的時候?qū)?.2ml的槍頭前端剪去一點，用槍頭將凝膠戳取下來并轉(zhuǎn)移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復(fù)吸打沖洗兩至三次，吸干離心管中所有水分封蓋保存并做好標記。離心管用進口離心管，以免塑料污染;水用去離子水或者雙蒸水;取點的時候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。

問題10. 一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜該如何選擇?
答：一級質(zhì)譜的鑒定方法又常稱為肽指紋圖譜鑒定(peptide-mass mapping，PMF)，二級質(zhì)譜的鑒定方法又常稱為串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。早期蛋白鑒定，因為考慮鑒定成本的問題，一般做測序生物的蛋白鑒定可以選擇一級質(zhì)譜，而非測序生物常選擇二級質(zhì)譜。現(xiàn)在，二級質(zhì)譜的價格也大大降低，和一級質(zhì)譜并無太大差異，而且可靠性和鑒定成功率都大大提高，本公司一般都推薦客戶(不管是研究測序生物還是非測序生物)直接做串聯(lián)質(zhì)譜，而不考慮進行肽指紋圖譜鑒定。

問題11. 質(zhì)譜鑒定大致是什么流程，公司一般都提供那些數(shù)據(jù)?
答：質(zhì)譜鑒定主要包括蛋白酶解、質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取、對庫檢索三個步驟。針對每一個蛋白點的鑒定，一般會提供三種數(shù)據(jù)，具體包括：質(zhì)譜圖(PDF格式，包括1張一級質(zhì)譜圖和5-10張二級質(zhì)譜圖)、質(zhì)譜峰列表(text格式，主要是一些質(zhì)譜碎片的信息)、檢索結(jié)果(自己建庫進行本地化檢索的一般提供的PDF格式或者excel格式，如果是Mascot在線檢索的一般提供網(wǎng)頁格式)。

問題12. 質(zhì)譜鑒定會不成功一般有哪些因素?
答：質(zhì)譜鑒定不成功主要可以分為兩類，一類是質(zhì)譜效果不好，一類是沒有可參考的蛋白數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜效果不好的原因又可以細分為蛋白點太淡以至于蛋白含量過低、蛋白點取得太小不利于操作、雖然經(jīng)過雙向電泳分離但卻是某幾個蛋白的混合蛋白點、蛋白酶解及質(zhì)譜操作失誤等，要避免這些因素需要盡量取顏色深一些的蛋白點，并且取的蛋白點面積需要適當大一些(對于某些很小但很清晰的蛋白點，取點的時候可是適當選擇孔徑大一些的槍頭，把邊上空白處適當取到一些也不要緊)，避免取點可能混合的蛋白點，具備豐富的酶解質(zhì)譜操作經(jīng)驗。而由于沒有可參考的數(shù)據(jù)庫導(dǎo)致的鑒定效果較差，可以通過更換范圍更大的數(shù)據(jù)庫、采用EST數(shù)據(jù)庫以及根據(jù)單個物種的蛋白數(shù)據(jù)庫構(gòu)建本地質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的方式得到解決。

問題13. 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定和質(zhì)譜測序有什么區(qū)別?
答：質(zhì)譜鑒定往往采用軟件對已有數(shù)據(jù)庫進行自動檢索匹配得到結(jié)果，而質(zhì)譜測序則需要根據(jù)質(zhì)譜峰圖中相鄰或者相近峰的分子量差異直接推算出肽段的序列。

問題14. 未知蛋白質(zhì)是通過質(zhì)譜還是蛋白質(zhì)測序儀來測序的呢?
答：現(xiàn)在比較簡單的方法是質(zhì)譜法，而且測一個樣品價格也不高。具體價格各個實驗室不一樣，100-500元吧。如果質(zhì)譜法不能確定的話還可以結(jié)合N端測序，可測10幾個氨基酸。兩個數(shù)據(jù)結(jié)合分析基本可以確定目的蛋白了，現(xiàn)在的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫相當強大了。
 

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